一、原理

超薄切片實際上是樣品的二維切片，不能表達(dá)細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)，而且在觀察切片后所拍攝的顯微照片時，容易造成錯誤的印象，用掃描電子顯微鏡能直接觀察標(biāo)本表面的三維空間結(jié)構(gòu)，真實地反映各種細(xì)胞表面和斷裂面的形態(tài)特征，其照明源與透射電鏡基本相同，由電子槍經(jīng)聚光鏡匯聚成極細(xì)胞的電子探針，電子探針受掃描發(fā)生器控制，在樣品表面逐點逐線的掃描，樣品被電子轟擊所產(chǎn)生的二次電子被收集、轉(zhuǎn)換、放大，在電視熒光屏上同步掃描成像。

二次電子的發(fā)射量與樣品的表面形態(tài)有關(guān)，從而在熒光屏上出現(xiàn)表面起伏的樣品立體圖像。掃描電鏡細(xì)胞樣品的預(yù)處理包括取材、固定、脫水等。

二、操作基本步驟

1 、取材

SEM掃描電鏡下觀察的樣品尺寸要求比較寬松，一般1cm3左右樣品都能適合大多數(shù)掃描電鏡觀察。

2 、固定

鋪片培養(yǎng)的細(xì)胞取出浸入 PBS 中，漂洗細(xì)胞表面。然后將細(xì)胞鋪片放入青霉素小瓶中，加 4 ℃ 預(yù)冷的 3% 戊二醛，在 4 ℃ 固定 2h 或過夜，吸出固定劑，用 PBS 浸洗 2 次，每次 10min ，再用 4 ℃ 預(yù)冷的 1% 鋨酸。在 4 ℃ 固定 1h ，然后用 PBS 浸洗 2 次，每次 10min 。

3 、脫水

丙酮 / 醋酸異戊酯( 1 ： 1 )脫水 10min ，接下來醋酸異戊酯脫水 30min ，或用系列梯度酒精( 30% 、 50% 、 70% 、 80% 、 90% 、 95% 、 **** )脫水，每種濃度酒精通過 2 次，每次 15min 。

4 、干燥

以臨界干燥法*理想，但要有專門的儀器臨界點干燥器。當(dāng)實驗室不具備此種儀器時，可采用冰凍干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的關(guān)鍵是乙腈置換。樣品經(jīng)上述處理后，浸入 520% 的乙腈溶液中，然后依次更換 70% 、 80% 、 90% 、 95% 、 **** 的乙腈溶液，每次浸泡 15-20min ，*后再換 **** 乙腈。然后進(jìn)行真空干燥。即將乙腈置換后的樣品連同青霉素瓶一起放到真空鍍膜臺的真空裝置內(nèi)，抽低真空，一般需 30-50min 。樣品干燥后，待其溫度升至室溫時再放氣，取出樣品。

5 、樣品導(dǎo)電處理

用真空噴鍍法。所用的儀器為真空噴鍍儀，樣品被安置在離蒸發(fā)源約 10-15cm 處的樣品臺上，樣品進(jìn)行旋轉(zhuǎn)活動，先噴碳。后噴金，噴鍍應(yīng)均勻，完成后鏡下觀察。